分泌物或尿中找到毛滴虫，是确诊本病的依据。
（1）悬滴检查法从阴道或尿道中采集的分泌物，直接涂在玻璃片上，加1～2滴温生理盐水，加盖玻璃立即置于显微镜下检查毛滴虫。男性患者也可把晨起第一次排尿的尿标本离心后，取1滴沉渣放在玻璃片上，如上法镜检。约半数病例可找到毛滴虫。前列腺液及精液可直接取1～2滴镜检找毛滴虫。
（2）涂片染色法分泌物涂在玻璃片上，自然干燥，加热固定。用Wright、Giemsa或Gram染色法染色，还可发现细菌、霉菌等。吖啶橙染色，用荧火显微镜检查，阳性率较其它方法高。当悬滴法阴性时，应作涂片染色检查。
（3）培养法常用肝浸液或蛋黄浸液培养基，如果妻子患有滴虫性阴道炎，丈夫的前列腺液、精液或尿道分泌物培养阳性率可达90%。
