定位过程是:前体蛋白在游离核糖体合成释放之后，在细胞质分子伴侣Hsp70的帮助下解折叠,然后通过N-端的转运肽同线粒体外膜上的受体蛋白识别,并在受体(或附近)的内外膜接触点(contactsite)处利用ATP水解产生的能量驱动前体蛋白进入转运蛋白(proteintranslocator)的运输通道,然后由电化学梯度驱动穿过内膜,进入线粒体基质。在基质中,由线粒体分子伴侣Hsp70(mHsp70)继续维持前体蛋白的解折叠状态。接着在Hsp60的帮助下,前体蛋白进行正确折叠,最后由转运肽酶切除导向序列,成为成熟的线粒体基质蛋白。