1 引言
目前，随着现代工业的不断发展，大量有毒有害废水排入到环境中，苯酚作为树脂制造、炼油、制药、焦碳原料等工业过程中的重要工业原料和产生的一种有机污染物，是工业污水中的主要有害物质，会对动、植物产生有毒甚至致命的危害.苯酚对水生生物具有很强的毒害作用，水体中5～25 mg · L-1的浓度即可对鱼类的生存构成威胁.长期饮用被苯酚污染的水或吸入低浓度酚蒸汽或会引起长期累积性中毒，而饮用高浓度酚溶液、吸入高浓度酚蒸汽则将引起急性中毒，尤其对人体神经系统危害较大.美国环保署把苯酚列入129种优先污染物和65种有毒污染物之列，我国也把苯酚列入中国环境优先处理的污染物“黑名单”之中.因此，去除水体中的苯酚等酚类污染物已成为污水处理的重要课题.
降解酚类的方法主要包括吸附法，电化学法和生物降解法等，其中生物降解因投资与运行成本低、二次污染小、处理效率高等优点，因而广泛应用于含酚废水处理.近年来，许多学者在这方面进行了大量的研究，从被酚类物质污染的环境中已分离得到多种降解酚类的微生物菌株，主要有根瘤菌、酵母菌、醋酸钙不动杆菌、假单胞菌、真养产碱菌、反硝化菌、红球菌等.其中，大部分研究主要集中于酵母菌、芽孢杆菌以及假单胞杆菌，对Acinetobacter属的细菌较少报道.生物降解法处理有毒和难降解的工业废水时，一般需要利用生物强化技术来驯化、筛选、诱变和选育高效微生物降解利用有毒有害物质，但工业废水组成成分的动态变化特点易对生物系统造成冲击，使其中的高效降解微生物菌群致死、流失.利用高效降解微生物对苯酚进行生物降解，能有效去除水体中的苯酚，但降解过程的影响因素较多，有必要从诸多影响因素中筛选出最为重要的影响因素，控制生物降解系统能较好的耐受环境冲击并高效运转.由于传统单因素实验不能确定主次因素的差别，而Plackett-Burman实验广泛应用于生物过程重要参数的筛选，通过对实验进行统计学设计和数据分析，筛选出对目标值影响最大的关键因素.响应面分析法(response surface methodology，RSM)是一种优化过程的有效方法，其中的Box-Behnken实验设计法比较常用，可用于确定实验因素及其交互作用在过程中对指标响应值的影响，精确的表述因素与响应值之间的关系.该法与正交设计比较，所需实验组数相对较少，更能直观体现因变量的最佳值.
本研究从株洲某化工厂污水处理车间氧化池的活性污泥中筛选分离出一株能高效降解苯酚的细菌菌株YH8，根据其形体特征、生理生化性状、BIOLOG鉴定、16S rDNA和gyrB序列分析进行分类鉴定，研究了该菌株降解苯酚的特性和初步探讨了该菌株降解苯酚的途径，并利用响应面法(RSM)优化菌株YH8降解苯酚的条件以提高降解效率.
2 材料与方法
2.1 实验材料
2.1.1 样品来源
从株洲市某化工厂废水处理车间氧化池采集的活性污泥作为筛选降解菌株的样品.
2.1.2 培养基
种子培养基(LB):每升含酵母粉5 g，胰蛋白胨10 g，NaCl 10 g，pH 7.0～7.2.无机盐培养基(MS):每升含K2HPO4 0.4 g、KH2PO4 0.4 g、NaCl 0.1 g、(NH4)2SO4 0.04 g、MgSO4 · 7H2O 0.1 g、MnSO4 · H2O 0.01 g、Fe2(SO4)3 · H2O 0.01 g、NaMoO4 · 2H2O 0.01 g，加水定容至1000 mL. 选择培养基:在已灭菌的MS培养基中，按浓度要求加入经0.22 μm微孔滤膜过滤的苯酚母液(10 g · L-1水溶液)，pH 7.0.以上固体培养基需加入1.8%的琼脂粉，经121 ℃、20min高压灭菌备用.
2.2 实验方法
2.2.1 菌株的分离纯化
准确称量氧化池活性污泥10 g，加入到装有90 mL三级水的锥形瓶中，30 ℃、200 r · min-1恒温摇床中振荡培养1 h.将重悬液按2%接种量加入到含苯酚的选择培养基中，苯酚浓度按100、200、500、1000、1200、1500、2000 mg · L-1依次提高以梯度驯化与富集降解菌.经过多次转接培养，梯度稀释培养液并涂布于含苯酚固体选择培养基上，在30 ℃恒温培养箱中倒置培养12 h.挑取菌落形态不同的单菌落接种至LB平板上，反复划线分离纯化得到纯菌株，保存于4 ℃冰箱中备用.
2.2.2 降解菌的筛选
将保藏的纯化菌株接种至LB平板上，划线分离单菌落.挑取单菌落接种到LB液体培养基中，30 ℃、200 r · min-1振荡培养至OD600为2.0(对数生长期末期).连续活化3代后，用生理盐水将发酵液离心洗涤2次并重悬菌体.以2%接种量接种至选择培养基中，振荡培养并间隔12 h检测培养液中苯酚含量，从中挑选降解苯酚能力最强的菌株.
2.2.3 形态特征鉴定
肉眼观察降解菌的菌落形状、大小、颜色、透明度、粘稠度、湿润度、隆起和边缘特征及是否产色素等，菌体染色后用高倍显微镜观察菌体革兰氏染色、鞭毛、荚膜、芽孢等结构，利用日立S-3400N型扫描电镜观察菌体大小和表面结构.
2.2.4 生理生化特性测定
参照文献进行生理生化鉴定，另采用BIOLOG全自动鉴定仪比对代谢指纹进行鉴定.采用添加5 μg · mL-1的抗生素，浓度梯度为50、100、400、500、800、1000、1200、1500、2000 mg · L-1的重金属盐的LB培养基培养YH8，检测菌株的相关抗性.
2.2.5 16S
rDNA基因序列的测定及分子系统发育树的构建 细菌基因组DNA采用EasyPure Genomic DNA Kit试剂盒，依据说明书提取.16S rDNA基因序列的获取参照文献.PCR产物经琼脂糖电泳检测纯化，送上海生工进行双向测序并拼接输出全序列，16S rDNA序列用BLAST进行相似性搜索和同源性比对，采用ClustalX 1.8进行序列匹配分析，通过MEGA6.0软件使用邻接法(Neighbor-Joining method)构建系统发育树，利用Bootstrap(1000次重复)检验各分支的置信度.
2.2.6 gyrB基因序列的测定及分子系统发育树的构建
gyrB基因是普遍存在于细菌中编码促旋酶B亚单位的基因，该基因进化速率快，每100万年的平均碱基替换率为0.7%～0.8%，gyrB基因弥补了非蛋白编码基因16S rDNA无法区分近源种的缺陷.以提取的细菌基因组DNA为模板，采用gyrB的保守引物对UP-1F/UP-2R进行PCR扩增，PCR反应体系及反应步骤参照文献.利用测序引物UP-1S:5′-GAAGTCATCATGACCGTTCTGCA-3′和UP-2sr: 5′-AGCAGGGTACGGATGTGCGAGCC-3′双向测序并连接，gyrB序列构建系统发育树的方法同上.
2.3 优化降解条件
经单因素实验确定影响YH8降解苯酚的环境因素.以苯酚降解率为响应值，采用三步法进行苯酚降解的优化.首先，利用Plackett-Burman设计选出对菌株降解苯酚效率影响较大的因素，然后利用最陡爬坡设计逼近最佳区域，最后利用响应曲面法中的Box-Benhnken设计进行实验.通过实验数据拟合响应面模型，最终确定最优降解条件并进行验证.实验数据借助SPSS和Design Expert软件进行分析.
2.4 苯酚降解机理的研究
2.4.1 细胞粗酶液的提取
将筛选到的菌株YH8接种至选择培养基(含1000 mg · L-1苯酚)和LB培养基中，30 ℃、200 r · min-1振荡培养32h，取对数生长期末期菌液50 mL，4 ℃、12000 r · min-1离心10 min，上清液即为胞外粗酶液，于-20 ℃冻存.菌体沉淀用pH 7.0的磷酸缓冲液清洗两次后，重悬于磷酸缓冲液中.在冰浴中，用HUP-400A型超声波细胞破碎仪破碎细胞，超声破碎30 s，间隔30 s，连续处理10 min.于4 ℃、13000 r · min-1离心20 min，上清液即为胞内粗酶液，于-20 ℃冻存.
2.4.2 菌株降解苯酚相关基因的PCR扩增
以细菌基因组DNA为模板，扩增苯酚羟化酶(LmPH)、邻苯二酚2，3-双加氧酶(C23O)和邻苯二酚1，2-双加氧酶(C12O)基因片段.LmPH引物为Lph:5′-AGGCATCAAGATCACCGACTG-3′;Lph2:5′-CGCCAGAACCATTTATCGATC-3′. C23O引物为C23OF:5′-GGTCTGATYGAAATGGAYCGCGA-3′;C23OR:5′-CGTTCGTTSAGCACCCGGTCGTG-3′. C12O引物为C12OF:5′-CCTGARCBGTHGGYTTT GCNCGTATGGATGA-3′;C12OR: 5′-TCACGRGTW GCRWARGCAAAGTC-3′.上述基因片段扩增体系与16S rDNA基因序列扩增体系相同，LmPH引物的PCR反应程序为:94 ℃预变性5min;94 ℃变性30s，52 ℃退火30s，72 ℃延伸1min，30个循环;72 ℃延伸10min.C12O和C23O的引物的PCR反应程序为:94 ℃预变性3min;94 ℃变性30s，59 ℃退火30s，72 ℃延伸1min，30个循环;72 ℃延伸10min.PCR产物经琼脂糖电泳检测、纯化、测序，测序结果用BLAST软件与Genbank数据库中已收录的基因序列进行同源性比对.
2.4.3 质粒的检测与消除
采用碱裂解法抽提质粒.质粒消除采用变温-SDS法.采用点接法将单菌落按相同位置接种至LB和选择培养基的平板上，对能在LB平板上生长而不能在选择培养基上生长的菌株进行质粒检测.挑取质粒消除突变菌株利用LmPH和C12O引物进行PCR扩增，检测突变菌株是否存在LmPH和C12O基因.
2.5 分析方法
2.5.1 细胞浓度的测定
采用可见分光光度法在600 nm下测定培养液的吸光度(OD600).
2.5.2 苯酚浓度的测定
采用4-氨基安替比林直接分光光度法测定苯酚的含量.
2.5.3 粗酶液活性测定
苯酚羟化酶活性的测定参照文献.分别参考文献检测邻苯二酚1，2-双加氧酶(C12O)和邻苯二酚2，3-双加氧酶(C23O)催化降解邻苯二酚的产物粘糠酸和2-羟基粘糠酸半醛，分别在260 nm和375 nm处有最大吸收峰.C12O和C23O酶活力测定以单位时间内反应产物分别在260 nm和375 nm处吸光度变化表示.反应体系为8.01 mL邻苯二酚、0.39 mL磷酸缓冲液(pH=7.0)和0.6 mL粗酶液，以缓冲液为参比.定义C12O(或C23O)活力单位(U)为25 ℃条件下每分钟反应产生1 μmol产物所需酶量.总蛋白含量用Bradford法测定，具体方法参见全式金Easy Protein Quantitative Kit试剂盒说明书.酶的比活力以每毫克的蛋白质中所含酶的活力单位数计算.
3 结果与讨论
3.1 菌株的分离与纯化
从活性污泥中分离纯化得到单菌落，划线分离后获得58株苯酚降解菌.通过复筛得到一株苯酚降解能力最强的菌株，命名为YH8.在驯化前，菌株YH8在苯酚浓度为1000 mg · L-1的选择培养基中，经30 ℃、200 r · min-1培养2d可使苯酚降解率达到78.54%.采用梯度浓度驯化后，菌株YH8可在4d内使1200 mg · L-1的苯酚降解89.47%.
3.2 菌株的鉴定
3.2.1 形态特征鉴定
菌株YH8的菌落呈圆形、浅白色、中间隆起、边缘整齐、湿润有光泽、较透明、较粘稠、不产色素.菌株细胞呈短杆状，有荚膜，无鞭毛与芽孢.经扫描电镜观察该菌在LB和选择培养基生长的菌株细胞差异，正常细胞表面较光滑，而苯酚则使该菌细胞表面出现凹陷(图 1～图 2).因苯酚在水溶液水解成酸性，高浓度的苯酚对细胞有一定的毒害作用，故选择培养基中培养的细胞易出现破损等现象.
图1 YH8在LB中的扫描电镜图(×20.0 k) 
3.2.2 生理生化鉴定
菌株YH8生理生化指标如下:革兰氏染色阴性、氧化酶阴性、过氧化氢酶阳性、苯丙氨酸脱氨酶阴性、吲哚实验阴性、淀粉水解阴性、硫化氢阴性、三糖铁阴性、硝酸盐还原阳性、V-P实验阴性、甲基红阴性、明胶液化阳性、纤维素酶阴性，4 ℃可生长，40 ℃不能生长，不具有运动性.将菌株YH8细胞悬浮液接种至BIOLOG GN2板微孔中，培养4h和16h后分别测定菌株代谢指数.经BIOLOG细菌鉴定系统分析，菌株YH8代谢指数与Acinetobacter guillouiae(Acinetobacter genospecies 11)的相似性为94%.
重金属抗性实验发现，菌株YH8能在分别添加1.0 g · L-1 Pb2+、1.5 g · L-1 Cr6+、1.8 g · L-1 Cr3+、0.5 g · L-1 Cd2+、1.0 g · L-1 Sb3+、3.0 g · L-1 Mn2+、1.0 g · L-1 Cu2+和1.0 g · L-1 Zn2+的LB培养基中正常生长，低于1 g · L-1的Cr3+、Mn2+、Zn2+可促进菌株的生长，而Cd2+、Hg2+、Ag+对菌株的生长有强烈的抑制作用.同样，龚斌从含有一定浓度的Cd2+、Pb2+、Mn2+、Ni2+的酚类废水中筛选到一株具有重金属抗性的假单胞菌JF-10，可用于重金属污染水体的苯酚污染生物修复.药敏实验结果表明菌株YH8能耐受5 μ g · mL-1的氯霉素、氨苄青霉素、卡那霉素、红霉素，而对四环素、庆大霉素、壮观霉素、头孢噻肟钠和利发霉素敏感.菌株在NaCl浓度为1%～12%的选择培养基中生长，表明菌株YH8可适应较高渗透压的环境.
3.2.3 分子生物学鉴定
菌株YH8的16S rDNA经PCR扩增得到一条约1.5Kb的DNA片段，测序得到1448bp的序列，其GenBank登录
号为KM658327.16S rDNA序列BLAST结果表明，菌株YH8与Acinetobacter guillouiae和Acinetobacter lwoffi的16S rDNA序列具有极高的同源性(99%).构建的16S rDNA序列系统发育树(图 3)表明菌株YH8与多株不动杆菌处在同一个分支.
图3 菌株YH8的16S rDNA基因系统发育树
经PCR扩增获得一段约1.3 kb的DNA片段，测序得到1182bp的序列，其GenBank登录号为KM658329.gyrB序列BLAST结果表明，菌株YH8与Acinetobacter baylyi的gyrB序列具有很高的同源性(98%)，而与其它菌株gyrB基因相似性均在98%以下，系统发育分析(图 4)表明，菌株YH8与Acinetobacter baylyi同处在一分支.因NCBI数据库中暂未收录Acinetobacter guillouiae的gyrB序列数据，故gyrB基因系统进化树中与YH8同一分支中未出现Acinetobacter guillouiae.综合16S rDNA和gyrB基因序列分析以及菌株形态和生理生化特征，菌株YH8鉴定为Acinetobacter guillouiae.
3.3 苯酚代谢途径及相关降解酶特性测定
3.3.1 降解酶基因扩增
按试剂盒说明从菌株YH8中提取到基因组DNA.分别利用LmPH(Lph1/Lph2)、C12O(C12OF/ C12OR)、C23O(C23OF/ C23OR)引物对菌株YH8的基因组DNA进行PCR扩增，结果发现引物LmPH、C12O有明显的扩增产物(图 5)，而C23O引物无明显的扩增产物.将扩增产物测序，获得LmPH基因大小为691 bp的片段，C12O基因大小为359 bp的片段.测序比对结果表明，菌株YH8的LmPH基因序列与登录号为D85083.1的LmPH序列同源性最高，达到97%;该菌株的C12O序列与登录号为Z36909.1的C12O序列同源性最高，达到96%.故证明菌株YH8基因组中包括LmPH和C12O基因.苯酚代谢途径的限速步骤由第一步的苯酚羟化酶的催化决定，自然环境中有单组分和多组分两种苯酚羟化酶，而多组分苯酚羟化酶是自然环境的优势类型(El-Sayed et al., 2014).(谭东徽等，2010)通过染色体步移技术克隆得到 总长约为6 kb的苯酚羟化酶基因，其中ORF4(开放阅读框)编码苯酚羟化酶大亚基，与编码产碱杆菌(Alcaligenes sp.)苯酚羟化酶大亚基基因的同源性达到93%，为构建高效基因工程菌提供了一定的理论基础.
图5 苯酚羟化酶基因片段和邻苯二酚1，2双加氧酶基因片段的扩增产物
3.3.2 降解酶活性测定
通过测定菌株YH8粗酶液中LmPH、C12O和C23O的活性，初步判断该菌株YH8降解苯酚的代谢途径.菌株YH8粗酶活性检测(表 1)表明，菌株YH8在LmPH的催化作用将苯酚转化为邻苯二酚，邻苯二酚在C12O的作用下通过邻位开环裂解途径降解.这与运用气质联用仪分析生物滴滤塔处理后的苯酚气体检测到的结果一致，推测苯酚的转化形式也相同.菌体破碎后上清液中LmPH和C12O的活性远高于未破碎菌体上清液中酶活性，由此可见该酶为胞内酶.以LB培养基为基质的两种上清液均未检测到酶活，而选择培养基中酶活远大于LB培养基中酶活，说明该菌株LmPH和C12O为诱导酶.在研究四溴双酚A(TBBPA)的微生物降解特性时，降解TBBPA的菌株H粗酶液中同样检测到一条明显区别于纯培养菌株的蛋白条带，证明红球菌株H相关降解酶是受TBBP诱导的特异性降解酶.
表1 不同基质中苯酚相关降解酶比活力
3.3.3 质粒检测和消除结果
采用全式金transgen Plasmid MiniPrep Kit试剂盒抽提菌株细胞中的质粒，1%琼脂糖凝胶电泳检测出现3条目的条带，说明菌株YH8具有一个5 kb左右的质粒.经变温-SDS法消除质粒后，通过点解法得到只能在LB平板上生长而不能在仅含浓度为1000 mg · L-1 苯酚的MS培养基平板上生长的菌株(图 6)，质粒消除率可达57.73%.经质粒检测，在质粒消除后的突变菌株中未发现质粒.挑取质粒消除突变菌株培养并经PCR扩增检测，无LmPH和C12O基因扩增条带出现(图 7).这说明经质粒消除后的菌株不能利用苯酚作为唯一碳源生长，且可初步判定苯酚相关降解基因位于质粒上.结果与对不动杆菌质粒及其特性的研究结果一致.
图6 LB(a)与苯酚(b)影印对照
图7 质粒消除前后LmPH和C12O基因扩增结果(a. LmPH，b. C12O)
3.4 菌株YH8生长及对苯酚降解的影响
3.4.2 菌株YH8利用苯酚生长和降解苯酚曲线
将菌株YH8接种于含1000 mg · L-1 苯酚的MS培养基中，30 ℃、200 r · min-1摇床培养，定时取样测定菌体生长量及选择培养基中的苯酚浓度.结果如图 8所示，YH8菌株的生长同步于对苯酚的降解，且菌株的生长和降解曲线的迟缓期为0～12 h，这一时间段为菌株YH8细胞合成苯酚相关降解酶的诱导期.菌株在12～96 h进入对数期，大约在 96 h最大菌体生长量达到0.71，此时苯酚降解率达到94.52%.
图8 菌株YH8利用苯酚生长和降解苯酚曲线
3.4.3 环境因素对菌株YH8生长和降解苯酚的影响
为了研究不同环境条件下菌株YH8对苯酚的降解情况，选择苯酚浓度、温度、接种量、初始pH、外加碳源、外加氮源5个影响因素作为研究对象，进行单因素实验.实验结果表明菌株YH8在苯酚浓度为1000～1200 mg · L-1时具有较高的降解率，高于1200 mg · L-1时，OD600值和苯酚降解率随苯酚浓度增加而迅速减小.菌株YH8生长和降解苯酚的适宜温度范围为24～32 ℃，在30 ℃时菌株生长量和降解率达到最大，即30 ℃初步确定为最适温度.菌株YH8生长和降解的临界温度为36 ℃，超过该温度，菌株YH8的生长和代谢便基本停止.菌株的最适接种量为5%，而菌株YH8在pH为9.0对苯酚的降解率达到最高.添加山梨醇和NaNO3作为最适外加碳源和外加氮源可有效提高菌体的生长速度和降解率，而王玉芬等(2011)研究发现球形红球菌只有在外加碳源的存在下才能降解氯代苯，而且不同碳源对氯代苯降解的影响变化较大，以苹果酸和乙酸做碳源时的降解效果最好，这可能与球形红球菌在好氧条件下必须通过共代谢才能降解氯代苯有关.
3.5 菌株YH8降解苯酚条件的优化
3.5.1 PB实验设计及结果
采用N=12 Placket-Burman 实验设计研究菌株YH8对苯酚的降解率产生影响的7个因素，每组实验重复3次.11个考察因素及其编码水平见表 2，其实验设计以苯酚降解率为响应值，借助实验设计软件Design Expert 7.1进行数据分析，其结果如表 3所示.通过比较各因素的显著性水平，筛选出对苯酚降解率影响较为显著的因素.
表2 Placket-Burman设计各因素与水平
从表 3可以看出，实验组5的苯酚降解率最高，达96.68%;实验组9的苯酚降解率最低，为35.78%.将实验数据采用SPSS V19.0拟合后，可得方程为:
Y= 71.02-9.87X2-0.91X3+6.33X5+9.56X6+10.23X8+1.44X9-1.69X10
式中，X2为苯酚浓度(mg · L-1);X3为接种量(%);X5为NaNO3浓度(%);X6为山梨醇浓度(%);X8为初始pH;X9为温度(℃);X10为培养时间(h);X1、X4、X7、X11为空白变量.
表3 Placket-Burman实验设计与结果
应用Design Expert软件分析得到模型的p为0.0396，表明所得回归方程较显著，即该模型在被研究的整个回归区域拟合性较好.复系数R2=0.9244，说明相关性较好.校正决定系数Adj R2=0.7921，表明79.21%的实验数据的变异性可用此回归模型来解释.通常情况下变化系数(Cv)越低，实验的可信度和精确度越高，Cv值等于12.85%，表示PB实验的可信度和精确度较好.精密度(Adeq Precision)是有效信号和噪声的比值，大于4.0视为合理，本实验精密度达到9.663.根据回归分析结果(见表 4)，从表 4可知苯酚浓度、山梨醇浓度以及初始pH对苯酚降解率存在显著影响，其中初始pH的p值最小(p=0.0178)，对菌株YH8降解苯酚效率影响最显著，其次是苯酚浓度(p=0.0200)，再次为山梨醇浓度(p=0.0222).其他4个因素，蔗糖浓度，苯酚浓度，温度，培养时间p值均大于0.05，对苯酚降解率没有明显影响.由此，初始pH、苯酚浓度和山梨醇浓度为影响苯酚降解率的关键因素.
表4 Placket-Burman实验分析结果
3.5.2 最陡爬坡实验设计与分析
响应面拟合方程只有考察临近区域时才能充分近似真实情况，所以应先逼近最大苯酚降解率区域后再建立有效的拟合方程.
根据Placket-Burman 实验筛选出的3个显著因素估计系数的正负效应，依次增大或减小，其他因素根据估计系数的正负效应分别取PB设计中的最高值和最低值.初始pH和胰蛋白胨浓度对苯酚降解率有显著正效应，应依次增加.而接种量是负效应，应依次减少.其他因素的取值为接种量5%、NaNO3浓度2%、温度30 ℃、培养时间96 h.由表 5数据分析可知，随着初始pH和山梨醇浓度的增加及苯酚浓度的减小，苯酚降解率呈先增大后减小的趋势.当初始pH为9.0，苯酚浓度为1100 mg · L-1，山梨醇浓度为5%时，苯酚降解率达到最大.因此，序号5的实验为最大响应值区域，故以此为中心点进行响应面分析.
表5 最陡爬坡实验设计及实验结果分析
3.5.3 响应面分析法确定最佳降解条件
响应面分析法是一种寻找多因子系统中最佳条件的数学统计方法，其中Box-Behnken和Box-Wilson中心组合设计是两种较常见的响应面分析法(RSA).通过爬坡路径法确定降解条件重要影响因子范围后，以初始pH、苯酚浓度和山梨醇浓度3种因子为自变量，以苯酚降解率为响应值，设计了3因素3水平的响应面分析试验.第13～15次实验为3次重复的中心点实验，用于考察模型的误差.实验设计及结果见表 6.
运用Design Expert 软件对15个实验点的响应面值进行回归分析，得二次多项式方程:
Y= 98.51-8.04A+6.15B+1.96C+2.89AB+1.82AC+5.80BC-7.45A2-10.07B2-10.80C2
式中，Y为苯酚降解率;A、B、C分别为初始pH、苯酚浓度、山梨醇浓度的编码值.相关系数R2=0.9972，说明方程的拟合度很好，可以用该方程进行试验结果预测.
表6 Box-Behnken 实验设计及结果
预测模型的p值远小于0.0001，说明该模型极显著.结合响应面分析三维图(图 9)，可直观的看出各因素之间的交互作用，各实验各因素对苯酚降解率的影响不是简单的线性关系，且对响应值的影响存在一极值点.
图9 菌株YH9各因素及其交互作用的响应面图
根据表 7方差分析数据可知，表明对苯酚降解率的影响排序为:初始pH(X2)﹥苯酚浓度(X6)﹥山梨醇浓度(X8).其中，X2、X6、X8、X2X6、X6X8、X22、X26、X28对Y的影响差异极显著，X2X8对Y的影响高度显著.失拟项数值为0.4185，远大于0.05，说明失拟不显著，该模型稳定，可以作为不同因素水平对苯酚降解率影响的预测.
根据模型构建的方程进行偏导微分处理，求导得出方程组的3个解:A=9.26，B=1163.63，C=7.81，即:初始pH 9.26、苯酚浓度1163.63 mg · L-1、山梨醇浓度7.81%.此时，YH8菌株对苯酚降解率的最大预测值为99.37%.
表7 Box-Behnken 实验回归分析结果
3.5.4 验证试验
为了验证模型预测的准确性和有效性，按照优化后的苯酚降解条件进行3组平行实验，实际检测苯酚的降解率达到98.95%，实验值与预测值之间具有良好的拟合性，表明回归方程能够比较真实的预测各因素对菌株YH8降解苯酚的影响.降解优化实验组与未优化实验组的结果比较发现，优化后的最佳降解条件可使菌株YH8对苯酚的降解率提高7%左右.等利用响应面法优化实验设计，研究了酵母浸出物、苯酚浓度、接种量3个因素对菌株Candida tropicalis Z-04降解高浓度苯酚效果的影响，拟合多元二次回归方程，并得到最佳降解条件下的实际降解率与预测值高度接近，说明响应面法能有效预测并优化菌株对目标化合物的降解.
4 结论
1)本研究从株洲某化工厂污水处理车间的污泥样品中分离得到一株苯酚降解菌，经形态特征、生理生化、BIOLOG微生物全自动鉴定仪和16S rDNA序列分析，该菌鉴定为Acinetobacter guillouiae，命名为YH8.该菌株能利用苯酚为唯一碳源和能源生长，30 ℃、200 r · min-1培养96 h可使初始浓度为1200 mg · L-1的苯酚降解率达到92.65%.
2)在以苯酚为碳源和能源的培养基中，检测到了与苯酚降解相关的主要酶活性-苯酚羟化酶和邻苯二酚1，2-双加氧酶，证明菌株YH8主要通过邻位开环裂解途径降解苯酚.对菌株YH8的相关降解酶研究表明，菌株YH8的相关降解酶位于胞内，只有诱导后菌体才能产生邻苯二酚1，2-双加氧酶的活性.利用特异引物进行PCR扩增可从菌株YH8基因组中扩增出一条251 bp的片段，测序比对结果显示该片段为邻苯二酚1，2-双加氧酶基因片段.
3)通过质粒检测和消除发现菌株YH8具有一个5 kb左右的质粒，且菌株YH8对苯酚的降解与质粒有关.此外菌株YH8可耐受多种重金属和高浓度NaCl的存在.
4)采用Placket-Burman实验设计筛选出影响菌株YH8降解苯酚的主要因素为初始pH、苯酚浓度和山梨醇浓度.应用响应面法分析优化设计苯酚降解的最佳条件为:初始pH 9.26、苯酚浓度1163.63 mg · L-1、山梨醇浓度7.81%、接种量5%、NaNO3浓度2%、温度30 ℃、培养时间96 h，在此条件下苯酚降解率可达98.95%.
