苯酚是造纸、炼焦、纺织和石油化工等工业废水中的主要污染物，即使在低浓度下对生物体也有毒害作用，如果不加以处理，会对人类健康和农作物的生长造成不良影响〔1〕，中国等许多国家已将其列为重点污染物。在环境中，利用微生物的活动降解苯酚具有处理成本低、二次污染小等优点〔2〕。国内外学者已分离得到一些降解苯酚的菌株，主要有假单胞菌（Pseudonomonas sp.）、酵母菌（Yeast trichosporon）、真养产碱菌（Alcaligenes eutrophus）等〔3, 4〕。这些菌种的生长都能以苯酚为单一碳源，但不同的微生物菌种和实验条件会导致微生物降解能力差异较大。
本实验从焦化废水处理系统中分离出一株沙雷氏菌株，该菌种能以苯酚为唯一碳源和能源，并且能够适应焦化废水复杂的水质环境。对该菌株的生长特性和动力学特性进行了研究，以进一步了解焦化废水中微生物的特性，从而为焦化废水的生物处理提供一定的理论基础。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 菌株
实验所用菌株分离自首都钢铁集团焦化厂曝气池中的活性污泥。
1.1.2 培养基
富集培养基：牛肉膏5.0 g，蛋白胨10.0 g，NaCl 5.0 g，蒸馏水1 000 mL。
唯一碳源培养基：KH2PO4 2.0 g，NH4Cl 1.0 g， CaCl2·2H2O 60.0 mg，MgCl2·6H2O 50.0 mg，FeCl3· 6H2O 2.5 mg，NaNO3 10.0 mg，Na2SO4 10.0 mg，蒸馏水1 000 mL，苯酚（根据需要加入）。
1.2 实验方法
1.2.1 菌种的驯化和分离
首先取5 mL 活性污泥，在富集培养基中对其进行富集培养，培养24 h 后转移到唯一碳源培养基中进行筛选。为使苯酚降解菌成为活性污泥体系中的优势菌种，在唯一碳源培养基中利用苯酚为唯一碳源进行梯度驯化，同时对水质进行监测并观察微生物生长情况。因为首钢焦化废水在进入生物处理系统前经过预处理，苯酚质量浓度在400 mg/L 左右，因此实验确定唯一碳源培养基中苯酚的质量浓度最终达到400 mg/L，共驯化288 h。
取经过驯化后的菌种培养液倍比稀释，涂布于富集培养基平板上，于30 ℃恒温培养箱中倒置培养，然后根据菌落形态，如菌落大小、边缘性状、菌落颜色、隆起程度和表面形状等的差别，对各菌落反复划线分离，得到纯菌株。之后将各菌落接种在富集培养基斜面上，于4 ℃冰箱中保藏，备用。
1.2.2 苯酚降解菌的筛选
用接种环取各接种斜面菌苔上的菌落，分别接种于装有50 mL 400 mg/L 苯酚及富集培养基的三角瓶内，调pH 为7.5，温度为30 ℃，在转速为120 r/min 的条件下振荡培养，同时做不接种对照。分别测定不同培养时间下各培养瓶内苯酚浓度，计算苯酚降解率。选取苯酚降解率较高的菌株作为优势菌株。
1.2.3 菌种最佳降解条件研究和动力学实验方法
通过研究pH、温度、菌种量和初始苯酚浓度对菌株生长及降解苯酚的影响，确定菌株最适生长条件。苯酚降解动力学实验在菌株最适生长条件下进行，唯一碳源培养基中初始苯酚质量浓度在0～400 mg/L，通过考察不同培养时间下菌体生长和苯酚降解情况，对菌株的生长特性和动力学特性进行研究。
1.2.4 分析方法
菌种浓度的测定采用比浊法〔5〕，使用分光光度计于波长600 nm 处测定其OD 值。苯酚含量采用 4-氨基安替吡啉直接吸光光度法进行测定〔6〕。
2 结果与讨论
2.1 菌种的分离及生理生化特性
经过分离纯化，共得到3 株具有较强降酚能力的菌株。经过进一步筛选，确定其中一株具有较高的苯酚降解效率。该菌株在富集培养基上生长，菌落表面光滑，呈圆形凸起，质地湿润，边缘整齐，呈红色。其生理生化特性如表 1 所示。初步确定该菌种为沙雷氏菌属〔7〕。后续实验均以该菌株为研究对象。
2.2 菌种降解条件研究
2.2.1 pH 对菌株降酚性能的影响
分别选取不同初始pH 的唯一碳源培养基对菌株进行培养，其他培养条件：温度为30 ℃，菌种量为 5%，初始苯酚质量浓度为400 mg/L，培养时间为 24 h。pH 对菌株降酚性能的影响如图 1 所示。
图 1 pH 对菌株降酚性能的影响
由图 1 可以看出，当pH＜8.0 时，苯酚降解率随 pH 的升高而增大；当pH＞8.0 时，苯酚降解率随pH 的升高而降低。这可能是由于pH 过高，抑制了菌种的生长和降酚酶的活性。相对而言，在pH=8.0 的条件下，菌株降解苯酚的效果最好。
2.2.2 温度对菌株降酚性能的影响
分别在温度为15、20、25、30、35 ℃的条件下培养菌株，其他培养条件：pH 为8.0，菌种量为5%，初始苯酚质量浓度为400 mg/L，培养时间为24 h。温度对菌株降酚性能的影响实验结果表明，在30～35 ℃ 范围内，菌株降酚性能较好，这说明在此温度内菌株细胞内的酶促反应速率较大，降解苯酚的速率较快。在温度为15 ℃和40 ℃时，降酚性能较低，这是因为在低温下酶的活性降低，而高温下，酶发生变性，丧失了生物活性。在温度为30 ℃下，菌株的生长情况和降酚性能最好。
2.2.3 菌种量对菌株降酚性能的影响
本实验选用菌种量分别为2%、5%、10%，其数值为菌种菌悬液与培养基的体积比。其他培养条件： pH 为8.0，温度为30 ℃，初始苯酚质量浓度为400 mg/L。菌种量对菌株降酚性能的影响见图 2。
图 2 菌种量对菌种浓度和降酚性能的影响
由图 2 可以看出，随着菌种量的增加，苯酚降解率也在增加，这也说明了菌种量的增加，可缩短菌株的迟滞期。虽然适当增加投菌量，有利于快速去除水体中的苯酚，但过多的增加投菌量并不能有效提高降解速率，反而增加了处理成本。综合考虑，本实验采用的菌种量为5%。
2.2.4 初始苯酚浓度对菌株降酚性能的影响
调节初始苯酚质量浓度为100、200、300、400、 500 mg/L，其他培养条件：pH 为8.0，温度为30 ℃，菌种量为5%，培养时间为12 h。初始苯酚浓度对菌株降酚性能的影响如图 3 所示。
图 3 初始苯酚浓度对菌株降酚性能的影响
由图 3可以看出，随着苯酚初始浓度的增加，菌株的生长繁殖速率和苯酚的降解速率随之下降。由此可以看出，苯酚对该菌株有一定的毒性，可抑制菌体的生长和繁殖，影响其对苯酚的降解。
2.3 菌种生长曲线及降解特性
将增值培养所得的菌种菌悬液接种于苯酚质量浓度为400 mg/L 的唯一碳源培养基中，在最佳培养条件下进行振荡培养。测定不同培养时间下的菌种浓度和苯酚浓度，结果如图 4 所示。
图 4 菌种生长曲线及苯酚降解曲线
由图 4 可知，菌株经过32 h 停滞期后进入对数增长期，60 h 以后处于稳定期。在52 h 内，该菌株能将400 mg/L 的苯酚完全降解。由苯酚降解曲线还可以看出，苯酚的降解主要发生在菌种的对数增长期，这主要是因为菌株在对数增长期时增值能力较强，对碳源的需求量大。培养120 h 后，碳源相对减少，随着营养物质的逐渐减少，菌体开始部分死亡，此阶段为菌株生长的衰亡期。菌种浓度下降的原因有3 个： 一是部分菌体因为粘结形成菌胶团而沉积在培养瓶底部； 二是菌种受到大量代谢废物的毒害而发生自溶现象，造成培养液中的菌体密度下降；三是培养基中营养物质减少，导致菌种的生长速率逐渐下降甚至为0，死亡数渐增，菌种进入衰亡期。
2.4 菌种降解动力学研究
2.4.1 低浓度苯酚菌株生长动力学
对单底物生物降解，一般采用Monod 动力学模型描述菌种细胞的比增长速率。Monod 方程描述的是微生物生长和限制生长的基质浓度之间的关系，适用于第一基质不进行自我抑制情况。方程表示为：
实验所测定的菌株生长Monod 方程拟合曲线如图 5 所示。
图 5 低浓度下菌株生长动力学曲线
由图 5 可知，实验数据与模型预测吻合良好。当苯酚初始质量浓度＜50 mg/L 时，菌种的比增长速率随着苯酚浓度的增加而增大，当苯酚初始质量浓度＞50 mg/L 时，菌种的比增长速率有所下降，此时，苯酚对菌种的生长产生了抑制作用。
拟合所得Monod 方程动力学参数：μmax=0.438 h-1， KS=27.206 mg/L。所得Monod 方程为μ= 0.438 S/(27.206+S) 。
2.4.2 高浓度苯酚菌株生长动力学
对于存在有毒底物的污水，毒物浓度达到一定值后微生物的活动将会受到抑制。目前，相关学者已经提出了几个数学模型用来定量描述有毒底物的抑制效果，其中大多数是由酶反应动力学演变而来， Haldane 方程是其中最常用的底物抑制细胞生长动力学模型之一。方程表示为：
实验所测定的菌株生长Haldane 方程拟合曲线如图 6 所示。
图 6 高浓度下菌株生长动力学曲线
从图 6 可以看出，实验数据与模型预测吻合良好。当苯酚初始质量浓度＞50 mg/L 时，随着苯酚浓度的增加，菌种的比增长速率逐渐下降，这是因为当苯酚浓度较高时，底物抑制作用成为主导作用，菌株的生长速率受到抑制。
拟合所得Haldane 方程动力学参数： μmax = 0.398 h-1，KS=9.70 mg/L，Ki=263.96 mg/L。所得Haldane 方程为μ= 0.398S/(9.7+S+ S2/263.96)。。
3 结论
（1）从焦化废水处理系统中分离出一株高效苯酚降解菌，经过生理生化鉴定初步确定为沙雷氏菌属，该菌株可利用苯酚为唯一碳源和能源。
（2）该菌株的最佳降解条件：pH 为8.0，温度为 30 ℃，菌种量为5%；菌种的降解性能受初始苯酚浓度的影响，并随着苯酚浓度的升高而降低。
（3）研究发现，高浓度苯酚会对菌种的生长产生抑制作用。低浓度苯酚条件下菌种生长动力学方程符合Monod 方程； 高浓度苯酚条件下菌种生长动力学方程符合Haldane 方程。
